<<<  Назад

2022 год, № 96

УДК: 575.113.2, 636.2.034
ГРНТИ: 34.15.05, 68.39.29

РАЗРАБОТКА ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТЕСТОВОЙ СИСТЕМЫ: ДИЗАЙН ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕННЫХ ПРАЙМЕРОВ ДЛЯ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ И ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ПРОВЕДЕНИЯ АНАЛИЗА ДЛЯ А1/А2-МОЛОКА

Генетические варианты белков молока на протяжении десятилетий вызывают большой интерес, поскольку они связаны с важными проблемами, такими как качественный состав и технологические свойства молока и молочных продуктов. Относительно недавно была выдвинута «гипотеза А1/А2». Согласно этой гипотезе утверждается, что вариант β-казеина (β-CN) A1 может быть диетическим фактором риска сердечно-сосудистых заболеваний, диабета 1 типа, синдрома внезапной детской смерти и неврологических расстройств из-за высвобождения особого полипептида β-казоморфина-7(BCM7) (60-66 аминокислотные остатки β-CN) - пептида, который получается из вариантов бета-казеина, несущих His67 (тип A1) вместо Pro67 (тип A2). В то же время, никаких доказательств таких побочных эффектов для естественных пептидов, ведущих свое происхождение из β-казеина, А2 не предполагается и не отмечается. Ввиду значимости определения как носительства определенных, контролирующих тип молока, однонуклеотидных полиморфизмов у коров, так и наличие BCM7 в молоке и продуктах его переработки, в настоящее время разработан целый ряд подходов для анализа на А1/А2 молоко. Основные подходы можно разделить на две группы, согласно применяемым лабораторным методам. В одном случае для прямого определения содержания в молоке и молочных продуктах β-казоморфина-7 используют методы биохимического анализа, проводя разделения белков молока с помощью изоэлектрофокусировки, определяя изоэлектрические точки соответствующих пептидов. В другом случае для проведения анализа используют различные модификации метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Данная работа является второй частью публикации, в которой описывается дизайн специфических флуоресцентно-меченных праймеров для использования в разработанной авторами оригинальной генетической тестовой системе анализа А1/А2 молока. В основе подхода лежит использование новой полимеразы - названной SNPase (она-же SNPdetect) DNA polymerase - на сегодняшний день это лучший фермент для проведения реакций аллельспецифичной ПЦР. В Российской Федерации описываемая система является единственной, основанной на таком принципе, и имеет ряд серьезных преимуществ перед используемыми ранее методами анализа А1/А2 молока. Помимо этого, в предлагаемой статье описаны оптимизированные условия для предложенной генетической тестовой системы и приведены примеры использования подхода для анализа представительной выборки из нескольких десятков высокопородных животных из стада учебно-опытного хозяйства «Краснодарское» кубанского ГАУ.
Ключевые слова: Мутация, полипептид, аллергенность, А2 молоко, полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ), полимеразная цепная реакция в реальном времени, аллельная структура стада.
DOI: 10.21515/1999-1703-96-247-258

Литература:

1. Bonfatti, V. Effects of β-κ-casein (CSN2-CSN3) haplotypes, β-lactoglobulin (BLG) genotypes, and detailed protein composition on coagulation properties of individual milk of Simmental cows / V. Bonfatti, G. Di Martino, A. Cecchinato, L. Degano & P. Carnier // Journal of Dairy Science. - 2010. - 93(8). - Р. 3809-3817. https://doi.org/10.3168/jds.2009-2779.
2. Caroli, A. M. Milk protein polymorphisms in cattle: Effect on animal breeding and human nutrition / A. M. Caroli, S. Chessa & G. J. Erhardt // Journal Dairy Science. - 2009. - 92(11). - 5335-5352. https://doi.org/10.3168/jds.2009-2461.
3. Farrell, H. M. Nomenclature of the proteins of cows’ milk - Sixth revision / H. M. Farrell, R. Jimenez-Flores, G. T. Bleck, E. M. Brown, J. E. Butler, L. K. Creamer et al. // Journal of Dairy Science. - 2004. - 87(6). - 1641-1674. https://doi.org/10.3168/jds.S0022-0302(04)73319-6.
4. Jakob, E. Technological properties of milk as influenced by genetic polymorphism of milk proteins - A review / E. Jakob & Z. Puhan (1992). - International Dairy Journal. - 2(3). - 157-178. https://doi.org/10.1016/0958-6946(92)90014-D.
5. Ketto, I. A. Effects of milk protein polymorphism and composition, casein micelle size and salt distribution on the milk coagulation properties in Norwegian Red cattle / I. A. Ketto, T. M. Knutsen, J. Øyaas, B. Heringstad, T. Ådnøy, T. G. Devold et al. // International Dairy Journal. - 2017. - 70. - 55-64. https://doi.org/10.1016/j.idairyj.2016.10.010.
6. Mayer, H. K.Composite milk protein phenotypes in relation to composition and cheesemaking properties of milk / H. K. Mayer, M. Ortner, E. Tschager & W. Ginzinger. -- International Dairy Journal. - 1997. - 7(5). - 305-310. https://doi.org/10.1016/S0958-6946(97)00019-8.
7. Lv, Z. Changes in metabolites from bovine milk with β-casein variants revealed by metabolomics / Z. Lv, H. Liu, Y. Yang, D. Bu, C. Zang, K. Yang // Animals. - 2020. - 10(6). - 954. https://doi.org/10.3390/ani10060954.
8. Ehrmann, S. Quantification of gene effects on single milk proteins in selected groups of dairy cows / S. Ehrmann, H. Bartenschlager & H. Geldermann // Journal of Animal Breeding and Genetics. - 1997. - 114(1-6). - 121-132. https://doi.org/10.1111/j.1439-0388.1997.tb00499.x.
9. Kaminski, ´S. Polymorphism of bovine beta-casein and its potential effect on human health / ´S Kaminski, ´A. Cie´slinska & E. Kostyra // Journal of Applied Genetics. - 2007. - 48(3). - 189-198. https://doi.org/10.1007/BF03195213
10. Godert, ¨ M. Background of beta-casein A2 in bovine milk - Strategies and limitations by breeding and the dairy industry with regard to a possible new demand / ¨ M. Godert, H. Brandt & G. Erhardt // Züchtungskunde. - 2017. - 89(6). - 451-474. https://www.zuechtungskunde.de/artikel.dll/zueku-2017-06-goedert-et-al_NjA5 MDQ2NA.PDF? UID =B62598BCA4C96C5A2A3705AE484E69331 CA588B4C9A052B1.
11. Mayer, H. K. Milk protein polymorphism in Austrian dairy cattle breeds / H. K. Mayer, A. Marchler, C. Prohaska & R. Norz (1997a) // Milchwissenschaft. - 52(7). - 366-369.
12. Farrell, H. M. Nomenclature of the proteins of cows’ milk - Sixth revision / H. M. Farrell, R. Jimenez-Flores, G. T. Bleck, E. M. Brown, J. E. Butler, L. K. Creamer et al. // Journal of Dairy Science. - 2004. - 87(6). - 1641-1674. https://doi.org/10.3168/jds.S0022-0302(04)73319-6.
13. Gallinat, J. L. DNA-based identification of novel bovine casein gene variants /j. L. Gallinat, S. Qanbari, ¨ C. Drogemüller, E. C. Pimentel, G. Thaller & J. Tetens // Journal of Dairy Science, - 2013. - 96(1). - 699-709. https://doi.org/10.3168/jds.2012-5908.
14. Cie´slinska,´ A. Milk from cows of different β-casein genotypes as a source of β-casomorphin7 / Cie´slinska,´ A., Kostyra, E., Kostyra, H., Olenski, ´ K., Fiedorowicz, E., & Kaminski, ´S. // International Journal of Food Sciences and Nutrition. - 2012. - 63(4). - 426-430. https://doi.org/10.3109/09637486.2011.634785.
15. Elliott, R. B. Type 1 (insulin-dependent) diabetes mellitus and cow milk: Casein variant consumption // R. B. Elliott, D. P. Harris, J. P. Hill, N. J. Bibby & H. E. Wasmuth // Diabetologia. -1999. - 42. - 292-296. https://doi.org/10.1007/s001250051153.
16. Ul Haq, M. R. Release of β-casomorphin-7/5 during simulated gastrointestinal digestion of milk β-casein variants from Indian crossbred cattle (Karan Fries) / M. R. Ul Haq, R. Kapila & S. Kapila // Food Chemistry. - 2015. - 168. - 70-79. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2014.07.024.
17. Truswell, A. S. The A2 milk case: A critical review / A. S. Truswell // European Journal of Clinical Nutrition. - 2005. - 59(5). - 623-631. https://doi.org/10.1038/sj.ejcn.1602104.
18. Küllenberg De Gaudry, D. Milk A1 β-casein and health-related outcomes in humans: A systematic review / D. Küllenberg De Gaudry, S. Lohner, C. Schmucker, P. Kapp, E. Motschall, ¨. S. Horrlein et al. // Nutrition Reviews. - 2019. - 77(5). - 278-306. https://doi.org/10.1093/nutrit/nuy063.
19. Oliveira Mendes, M. A2A2 milk: Brazilian consumers’ opinions and effect on sensory characteristics of Petit Suisse and Minas cheeses / M. Oliveira Mendes, M. Ferreira de Morais & J. Ferreira Rodrigues // LWT - Food Science and Technology. - 2019. - 108. - 207-213. https://doi.org/10.1016/j.lwt.2019.03.064.
20. Givens, I. Proportions of A1, A2, B and C β-casein protein variants in retail milk in the UK / I. Givens, P. Aikman, T. Gibson & R. Brown // Food Chemistry. - 2013. - 139(1-4). - 549-552. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2013.01.115.
21. Bentivoglio, D. Is there a promising market for the A2 milk? Analysis of Italian Consumer Preferences / D. Bentivoglio, A. Finco, G. Bucci & G. Staffolani // Sustainability. - 2020. - 12(17). - 6763. https://doi.org/10.3390/su12176763.
22. Massella, E. Evaluation of bovine beta casein polymorphism in two dairy farms located in northern Italy / E. Massella, S. Piva, F. Giacometti, G. Liuzzo, A. V. Zambrini & A. Serraino // Italian Journal of Food Safety. - 2017. - 6(3). - 131-133. https://doi.org/10.4081/ijfs.2017.6904.
23. De Noni, I. Release of β-casomorphins 5 and 7 during simulated gastro-intestinal digestion of bovine β-casein variants and milk-based infant formulas / I. De Noni // Food Chemistry. - 2008. - 110(4). - 897-903. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2008.02.077.
24. Hollar, C. M. Separation of β-casein A1, A2, and B using cation-exchange fast protein liquid chromatography / C. M. Hollar, A. J. R. Law, D. G. Dalgleish, J. F. Medrano & R. J. Brown // Journal of Dairy Science. - 1991. - 74(10). - 3308-3313. https://doi.org/10.3168/jds.S0022-0302(91)78517-2.
25. Bonfatti, V. Validation of a new reversed-phase high-performance liquid chromatography method for separation and quantification of bovine milk protein genetic variants // V. Bonfatti, L. Grigoletto, A. Cecchinato, L. Gallo & P. Carnier // Journal of Chromatography A. - 2008. - 1195(1-2). - 101-106. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2008.04.075.
26. De Poi, R. Development of an LC-MS method for the identification of β-casein genetic variants in bovine milk / R. De Poi, E. De Dominicis, E. Gritti, F. Fiorese, S. Saner, & P. P. de Laureto // Food Analytical Methods. - 2020. - 13(12). - 2177-2187. https://doi.org/10.1007/s12161-020-01817.
27. Duarte-V´ azquez, M. A. Use of urea-polyacrylamide electrophoresis for discrimination of A1 and A2 beta casein variants in raw cow’s milk / M. A. Duarte-V´azquez, C. R. García-Ugalde, ´ B. E. Alvarez, L. M. Villegas, ´ B. E. García Almendarez, J. L. Rosado et al. // Journal of Food Science and Technology. - 2018. - 55(5). - 1942-1947. https://doi.org/10.1007/s13197-018-3088-z.
28. Braunschweig, M. H. Associations between casein haplotypes and milk traits of Braunvieh and Fleckvieh / M. H. Braunschweig (1998) // Doctoral thesis, ETH Zurich, Switzerland. - 1998). - DOI: 10.3929/ethz-a-001988576
29. Smiltina, D. Molecular genetics analysis of milk protein gene polymorphism of dairy cows and breeding bulls in Latvia / D. Smiltina & Z. Grislis // Agronomy Research. - 2018. - 16(3). - 900-909. https://doi.org/10.15159/AR.18.084.
30. Kuˇcerova, ´ J. Milk protein genes CSN1S1, CSN2, CSN3, LGB and their relation to genetic values of milk production parameters in Czech Fleckvieh / ´J. Kuˇcerova, A. Matˇejíˇcek, O. M. Jandurov´a, P. Sørensen, ´ E. Nˇemcova, M. Stípkov ˇ et al. // Czech Journal of Animal Science. - 2006. - 51(6). - 241-247. https://doi.org/10.17221/3935-cjas. ACRS.
31. Jann, O. A new variant in exon VII of bovine β-casein gene (CSN2) and its distribution among European cattle breeds // O. Jann, G. Ceriotti, A. Caroli, & G. Erhardt // Journal of Animal Breeding and Genetics. - 2002. - 119(1). - 65-68. https://doi.org/10.1046/j.1439-0388.2002.00318.x.
32. Chessa, S. Development of a SNP genotyping microarray platform for the identification of bovine milk protein genetic polymorphisms / S. Chessa, F. Chiatti, G. Ceriotti, A. Caroli, C. Consolandi, G. Pagnacco et al. // Journal of Dairy Science. - 2007. - 90(1). - 451-464. https://doi.org/10.3168/jds.S0022-0302(07)72647-4
33. Giglioti, R. New high-sensitive rhAmp method for A1 allele detection in A2 milk samples / R. Giglioti, G. Gutmanis, L. M. Katiki, C. H. Okino, M. C. de Sena Oliveira & A. E. Vercesi Filho // Food Chemistry. - 2020. - 313(5). - Article 126167. https://doi.org/10.1016/j. foodchem.2020.126167.
34. https://evrogen.ru/kit-user-manuals/SNP detect.pdf; (Официальный сайт ООО «Евроген», Москва, Россия; время обращения 11.05.2022)
35. Stadler, J. SNPaseARMS qPCR: Ultrasensitive Mutation-Based Detection of Cell-Free Tumor DNA in Melanoma Patients /j. Stadler, J. Eder, B. Pratscher, S. Brandt, D. Schneller, R. Müllegger et al. // PLoS ONE 10(11): e0142273. - 2015. DOI: 10.1371/ journal.pone.0142273.
36. Князева, В. В. Разработка генетической тестовой системы: Получение фрагментов гена β-казеина крупного рогатого скота, содержащих нуклеотидные замены, характерные для различных аллельных форм белка / В. В. Князева, А. В. Гарковенко, В. В. Радченко, А. Г. Кощаев // Труды Кубанского государственного аграрного университета. - 2022. - № 2(95). - С. 157-164.
37. Гладырь, Е. А. Молекулярная диагностика генетического дефекта FMO в айрширской породе крупного рогатого скота / Е. А. Гладырь, Е. Н. Коновалова, О. В. Костюнина, А. Г. Кощаев // Труды Кубанского государственного аграрного университета. - 2019. - № 80. - С. 215-221.
38. Кощаев, А. Г. Генетическое разнообразие крупного рогатого скота, разводимого в Краснодарском крае / А. Г. Кощаев, С. Ю. Шуклин, И. В. Щукина // Аграрный вестник Урала. - 2017. - № 12 (166). - С. 5.

Авторы:

1. Князева Валерия Владимировна, аспирант, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина».
2. Гарковенко Алексей Вячеславович, науч. сотрудник, генеральный директор, ООО «ДНК Экспертиза»; Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина».
3. Радченко Виталий Владиславович, канд. биол. наук, вед. науч. сотрудник, ООО «ДНК Экспертиза».
4. Кощаев Андрей Георгиевич, д-р биол. наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина».