<<<  Назад

2022 год, № 95

УДК: 575.113.2, 636.2.034
ГРНТИ: 34.15.05, 68.39.29

РАЗРАБОТКА ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТЕСТОВОЙ СИСТЕМЫ: ПОЛУЧЕНИЕ ФРАГМЕНТОВ ГЕНА БЕТА-КАЗЕИНА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, СОДЕРЖАЩИХ НУКЛЕОТИДНЫЕ ЗАМЕНЫ, ХАРАКТЕРНЫЕ ДЛЯ РАЗЛИЧНЫХ АЛЛЕЛЬНЫХ ФОРМ БЕЛКА

Улучшение среднего уровня жизни граждан и увеличение доступности продуктов питания ставит перед сельскохозяйственной наукой новые задачи. На первый план выходит не просто количество пищи, но и обеспечение ее наилучшего из возможных качества. Современные методы биологической науки позволяют подойти к задачам на стыке сельского хозяйства, пищевой промышленности и медицины, сделав продукты питания инструментом профилактики болезней и лечения. Ярким примером является так называемое А2 молоко, интерес к которому как с точки зрения профилактики аллергических и воспалительных явлений, так и с точки зрения коммерческой выгоды для производителей молока и молочных продуктов, растет в мире и России. Биологическая сторона вопроса заключается в том, что при переваривании в организме человека белков коровьего молока возникают несколько биоактивных пептидов, влияющих на пищевые свойства молочных продуктов. Так при расщеплении белка бета-казеина (β-CN) среди прочих возникает β-казоморфин-7 (BCM7) (60-66 аминокислотные остатки β-CN) - пептид, который получается из вариантов бета-казеина, несущих His67 (тип A1) вместо Pro67 (тип A2). Двумя наиболее распространенными вариантами белка β-CN являются A2 (исходный) и A1, отличающийся от A2 одной аминокислотной заменой (Pro67-His67). Таким образом, предпочтительны варианты с Pro67 с заменой А на С во втором положении триплета CAT [His] на CCT [Pro]. В настоящее время «А2-молоко» производится в разных странах, заявляя о своих потенциальных преимуществах в области здоровья человека. Многочисленные исследования в разных странах показали, что пептид BCM7, образующийся при расщеплении А1 бета-казеина в ЖКТ, может быть одним из факторов развития детского аутизма, приводить к задержке психомоторного развития и нарушениям мышечного тонуса. В предлагаемом проекте ставится задача разработать дизайн модифицированных флюоресцентно-меченых праймеров и создать на их основе набор для определения методом ПЦР в реальном времени животных, несущих вариант гена бета-казеина (β-CN), который обеспечивает продукцию А2 молока. В настоящее время в России массово применяется сравнительно дешевый, но трудоемкий и длительный по времени метод определения интересующей нас мутации на основе RFLP-анализа. Этот метод предполагает получение ПЦР-фрагмента, несущего мутацию, его выделение и очистку (или смену буферной среды, в которой находится ДНК-фрагмент), обработку полученного фрагмента определенной рестриктазой и электрофоретический анализ продуктов расщепления. Помимо повышенного требования к квалификации персонала, сложности и длительности этого устаревшего подхода, на всех стадиях возможна контаминация исследуемого образца ДНК других животных. Это ставит под сомнение результаты данного типа анализа при массовом исследовании большого числа голов КРС. Преимуществом предлагаемого нами подхода на основе ПЦР в реальном времени является точность, быстрота, отсутствие загрязнения, надежная идентификация гомо- и гетерозигот, возможность ранней постнатальной идентификации животных, несущих желаемый генотип. Данная работа является первой частью публикации, в которой описывается получение фрагментов гена бета-казеина, каждый из которых несет свой вариант нуклеотидного полиморфизма, характерного для определённых изоформ белка. Полученные фрагменты ДНК необходимы для разработки оптимального дизайна ген-специфичных праймеров и аллель-специфических зондов. Используя описанные в данной статье фрагменты ДНК, будет проводиться проверка работоспособности разрабатываемой генетической тестовой системы и оптимизация условий проведения анализа.
Ключевые слова: Мутация, полипептид, аллергенность, А2 молоко, полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ), полимеразная цепная реакция в реальном времени, аллельная структура стада.
DOI: 10.21515/1999-1703-95-157-164

Литература:

1. Barnett, M. P. Dietary A1 β-casein affects gastrointestinal transit time, dipeptidyl peptidase-4 activity, and inflammatory status relative to A2 β-casein in Wistar rats / M. P. Barnett et al. // Int Food Sci Nutr. - 2014 - Sep;65(6):720-7; doi:10.3109/09637486.2014.898260. 2.
2. Haq, M. R.Comparative evaluation of cow b-casein variants (A1/A2) consumption on Th2-mediated inflammatory response in mouse gut / M. R. Haq et al. // Eur J Nutr. - 2014 - No. 53. - P. 1039-1049. doi:10.1007/s00394-013-0606-7.
3. Jinsmaa, Y. Enzymatic release of neocasomorphin and beta-casomorphin from bovine beta-casein / Y. Jinsmaa et al. // Peptides. - 1999. - No. 20. - P. 957-962.
4. Becker, A. Effects of beta-casomorphin derivatives on gastrointestinal transit in mice / A. Becker et al. // Biomed Biochim Acta. - 1990 - No. 49. - P. 1203-1207.
5. Mihatsch, W. A. Hydrolysis of casein accelerates gastrointestinal transit via reduction of opioid receptor agonists released from casein in rats / W. A. Mihatsch et al. // Biol Neonate. - 2005. - No. 87 - P.160-163.
6. Zoghbi, S. Beta-Casomorphin-7 regulates the secretion and expression of gastrointestinal mucins through a mu-opioid pathway / S. Zoghbi et al. // Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. - 2006 - No. 290 - P. 1105-1113.
7. Kayser, H. Stimulation of human peripheral blood lymphocytes by bioactive peptides derived from bovine milk proteins / H. Kayser et al. // FEBS Lett. - 1996 - No. 383. - P. 18-20.
8. Trivedi, M. S. Food-derived opioid peptides inhibit cysteine uptake with redox and epigenetic consequences / M. S. Trivedi et al. // J Nutr Biochem. - 2014. - No. 25. - P. 1011-1018.

Авторы:

1. Князева Валерия Владимировна, аспирант, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина».
2. Гарковенко Алексей Вячеславович, научный сотрудник, ООО «ДНК Экспертиза»; Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина».
3. Радченко Виталий Владиславович, канд. биол. наук, вед. науч. сотрудник, ООО «ДНК Экспертиза».
4. Кощаев Андрей Георгиевич, д-р биол. наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина».